科研产出
类有机磷农药宽谱酶联免疫吸附分析方法的建立
《西南农业学报 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：【目的】制备识别二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药（DPPs）的单克隆抗体，建立其间接竞争酶联免疫吸附分析法（ic-ELISA）,为实现农产品有机磷农药残留快检提供技术支持。【方法】以化合物4-（二乙氧基硫代磷酰氧基）-肉桂酸为半抗原，制备完全抗原。筛选免疫小鼠，制备稳定分泌可识别DPPs抗体的单克隆细胞株，筛选出抗原和抗体最佳工作浓度组合，建立该单抗的ic-ELISA标准曲线，并分析该单抗与6种DPPs的交叉反应率，评估ic-ELISA的广谱性。利用所得抗体与喹硫磷交叉反应最强的特性对采购的柑橘和鲜橙样品进行喹硫磷添加回收试验。【结果】成功合成识别DPPs的人工抗原，包括包被抗原DPPs-OVA和免疫抗原DPPs-BSA。通过有限稀释法筛选获得灵敏度高、广谱性最强的单克隆细胞株5G8。以0.5μg/mL包被抗原DPPs-OVA、1.0μg/mL抗体5G82D5为最佳工作浓度组合，将细胞株筛选过程中抗体识别率较高的有机磷农药——对硫磷选定为抑制标准物，建立对硫磷ic-ELISA及其标准曲线，其半抑制浓度(IC50)为41.78 ng/mL,检测范围(IC20～IC80)为3.21～239.59 ng/mL;所建立的ic-ELISA与5种DPPs（蝇毒磷、喹硫磷、甲拌磷、甲基对硫磷和倍硫磷）均存在不同程度的交叉反应，其中以喹硫磷的交叉反应率最高，达19.79%。比较ic-ELISA和气相色谱法（GC）对柑橘和鲜橙样品中喹硫磷的添加回收结果发现，ic-ELISA的添加回收率为75.80%～116.12%,GC的添加回收率介于92.5%～115.00%,2种方法的检测结果一致性较好。【结论】建立的ic-ELISA经GC交叉验证准确性较高，可用于快速检测农产品中的喹硫磷残留。
关键词： 二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药（DPPs） 单克隆抗体 间接竞争酶联免疫吸附分析法（ic-ELISA） 气相色谱法（GC） 农药残留检测
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A型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
《黑龙江畜牧兽医 》 2016 北大核心
摘要：为了深入了解VP1蛋白的结构和功能,并建立A型口蹄疫(FMD)血清抗体检测方法,试验采用纯化的重组蛋白p ET-32a-VP1免疫Balb/c小鼠,以纯化的重组蛋白p GEX-6p-1-VP1作为检测抗原包被酶标板检测抗体效价。将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,其杂交瘤细胞用间接ELISA法进行筛选,获得4株能稳定分泌抗口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1的特异性杂交瘤细胞株,分别命名为1D10、3D12、4E12和5G7。结果表明:这4株单克隆抗体均为Ig M亚型和κ轻链,单克隆抗体间可能识别同一个表位,或表位重叠性大。4株单克隆抗体均能被A型FMDV阳性血清所阻断,具有特异性,且以单克隆抗体4E12产生的抗体效价最高、稳定性强、亲和力最大,并能与重组蛋白FMDV-A-VP1特异性结合。说明单克隆抗体4E12可作为单克隆抗体竞争ELISA法的竞争抗体用于检测A型FMDV血清抗体。
关键词： A型口蹄疫病毒 VP1蛋白 单克隆抗体 制备 鉴定 竞争ELISA法
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A型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备鉴定
《黑龙江畜牧兽医(上半月) 》 2016 北大核心
摘要：为了深入了解VP1蛋白的结构和功能,并建立A型口蹄疫(FMD)血清抗体检测方法,试验采用纯化的重组蛋白pET-32a-VP1免疫Balb/c小鼠,以纯化的重组蛋白pGEX-6p-1-VP1作为检测抗原包被酶标板检测抗体效价.将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,其杂交瘤细胞用间接ELISA法进行筛选,获得4株能稳定分泌抗口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1的特异性杂交瘤细胞株,分别命名为1D10、3D12、4E12和5G7.结果表明:这4株单克隆抗体均为IgM亚型和K轻链,单克隆抗体间可能识别同一个表位,或表位重叠性大.4株单克隆抗体均能被A型FMDV阳性血清所阻断,具有特异性,且以单克隆抗体4E12产生的抗体效价最高、稳定性强、亲和力最大,并能与重组蛋白FMDV-A-VP1特异性结合.说明单克隆抗体4E12可作为单克隆抗体竞争ELISA法的竞争抗体用于检测A型FMDV血清抗体.
关键词： A型口蹄疫病毒 VP1蛋白 单克隆抗体 制备 鉴定 竞争ELISA法
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甘蔗宿根矮化病病原菌一推测膜蛋白基因(Lxx18460)单克隆抗体的制备和检测
《南方农业学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：【目的】对甘蔗宿根矮化病病原菌(Leifsonia xyli subsp.xyli,Lxx)一推测为抗K因子的膜蛋白基因(Lxx18460)进行研究,为今后研究该基因在感病甘蔗体内表达打下基础。【方法】诱导表达并纯化含有推测为抗K因子的膜蛋白Lxx18460基因的p ET-30a质粒菌液,委托南京金斯瑞生物科技有限公司制备单克隆抗体;用Western blotting对细菌及感病和健康甘蔗样品总蛋白进行检测。【结果】Lxx18460基因具有特异性,只存在于甘蔗Lxx中。ELISA单克隆抗体效价大于1∶512000,能够灵敏地检测细菌总蛋白和甘蔗样品蛋白。Western blotting检测结果表明,Lxx18460基因在细菌中和感病甘蔗样品中表达,在健康甘蔗样品中几乎不表达。【结论】Lxx18460基因具有特异性,是Lxx中的抗K因子的膜蛋白基因,能够在细菌和感病甘蔗样品体外进行表达。
关键词： 甘蔗宿根矮化病 Lxx18460基因 单克隆抗体 ELISA检测 Western blotting检测
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