科研产出
葡萄霜霉菌效应因子PvCRN91功能分析
《南方农业学报 》 2025 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆葡萄霜霉菌PvCRN91基因并研究其功能，为揭示葡萄霜霉菌的致病机制提供理论参考。【方法】利用分子克隆技术扩增PvCRN91基因全长，并分析其编码蛋白的生物信息学特征。通过本氏烟上瞬时表达效应蛋白PvCRN91，观察其在烟草叶片上的表现和对马铃薯疫霉激发子INF1和小鼠促凋亡蛋白BAX触发细胞坏死的影响。构建pBWA(V)HS-PvCRN91-GFP融合表达载体，在葡萄叶片和烟草叶片瞬时表达，并分别接种葡萄霜霉菌和烟草疫霉，分析其促进病原菌侵染的能力。构建pBI221-PvCRN91-GFP表达载体，并在烟草原生质体瞬时表达，分析PvCRN91蛋白的亚细胞定位情况。构建pBWA(V)HS-PvCRN91-3×Flag融合表达载体，通过免疫沉淀—质谱联用技术（IP-MS）方法筛选与PvCRN91互作的靶蛋白。【结果】PvCRN91基因编码区（CDS）全长351 bp，编码116个氨基酸残基，蛋白相对分子量约13.03 kD，不含有信号肽、核定位序列（NLS）和跨膜结构域，含有1个Crinkler结构域和consen-sus disorder prediction区域；PvCRN91的二级结构含有α-螺旋（31.90%）、延伸链（22.41%）和无规则卷曲（45.69%）。序列比对发现，在多种疫霉菌、水霉菌、霜霉菌和丝囊霉菌中均存在与PvCRN91蛋白一致性较高（56.60%～74.77%）的序列，推测PvCRN91是一个保守的效应因子。PvCRN91蛋白不具有触发烟草细胞坏死的能力，但能完全抑制INF1和BAX诱导的细胞程序性死亡（PCD）反应。PvCRN91效应因子可促进葡萄霜霉菌和烟草疫霉菌的侵染。PvCRN91蛋白亚细胞定位于细胞质和细胞核，推测其在细胞质或细胞核中与寄主靶蛋白互作，抑制寄主的免疫反应。IP-MS方法初步筛选到252个可能与PvCRN91互作的靶蛋白，通过多个代谢途径影响烟草的生理生化和防御反应。【结论】PvCRN91是一个毒力因子，可能在细胞质或细胞核中操纵寄主的靶蛋白，降低植物的防卫反应，促进病原菌的侵染。
关键词： 葡萄霜霉菌 PvCRN91基因 效应因子 Crinkler结构域 防卫反应
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葡萄霜霉菌糖基水解酶基因的表达模式与功能分析
《中国农业科学 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）糖基水解酶（glycosyl hydrolase,GH）基因（PvGH），分析其特征以及在葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中的表达模式，研究其抑制/促进烟草叶片程序性细胞死亡（PCD）以及影响烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）侵染的能力，为深入探究调控寄主植物免疫的机制提供理论依据。【方法】以葡萄霜霉菌Pv5-27菌株作为试材，采用RT-PCR方法扩增获得8个PvGH基因全长，并对其基因及编码蛋白进行生物信息学分析；利用酵母信号肽诱捕系统（SST）验证PvGH的分泌活性；利用实时荧光定量PCR技术检测葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中PvGH的表达模式；同时利用农杆菌介导的PVX病毒表达系统在本氏烟上瞬时表达PvGH效应蛋白，分析其对INF1和BAX触发的烟草PCD的抑制能力以及促进烟草疫霉侵染的能力。【结果】8个PvGH基因序列与通过全基因组预测的序列完全一致，长度为1 092—1 392 bp，分别编码364—464个氨基酸，与其他卵菌同源蛋白相似性高达60.62%—86.36%。8个PvGH均不含跨膜结构域，其二级结构差异较大，三级结构与其他蛋白三级结构相似性较低，呈现非常独特的三级结构。使用SingalP 5.0软件对编码的蛋白进行信号肽预测，发现它们均含有20—26 aa的信号肽，但通过SST验证结果显示PvG09279和PvG13517并不具有分泌特性。保留、缺失或者替换信号肽的8个PvGH均可抑制BAX触发的本氏烟PCD，并促进烟草疫霉的侵染，表明PvGH效应蛋白发挥其毒力不依赖于信号肽。PvGH在葡萄霜霉菌侵染初期表达上调，进一步表明其在病原菌与寄主互作中的重要作用。【结论】在侵染寄主过程中，葡萄霜霉菌分泌的PvGH通过抑制寄主PTI反应参与致病过程。
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葡萄霜霉菌糖基水解酶基因家族的生物信息学分析
《南方农业学报 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：【目的】分析预测葡萄霜霉菌糖基水解酶（Glycoside hydrolases,GHs）基因家族,为深入研究GHs基因在葡萄霜霉菌致病过程中的作用机理提供理论依据。【方法】利用SignalP 5.0 Server、Cluster W、MEGA 6.0和MEME等生物信息学相关软件对已发表的葡萄霜霉菌全基因组60个GHs基因的基本特征、基因组分布特点及其编码蛋白保守基序、结构域和亚细胞定位等进行生物信息学分析。【结果】葡萄霜霉菌60个GHs基因编码的蛋白长度在128～774 aa,且大部分集中在200～500 aa,其中53个蛋白具有信号肽,蛋白质分子量在14.90～85.45 kD,理论等电点（pI）在3.85～10.39;这些基因在基因组中分布不均匀,其中有27个GHs基因存在串联重复和成簇聚集分布现象,数目最多的3个GHs家族（GH131、GH17和GH6）集中分布在7个scaffold中;序列比对和系统发育进化树分析发现,串联重复和成簇聚集分布的GHs基因处于同一个分支中;motif富集分析发现3个不同的motif,且motif2在葡萄霜霉菌GH6、GH17和GH131等3个家族基因中保守,结构域分析推测大部分GHs家族基因均参与细胞壁的生物过程;亚细胞定位预测结果表明,有53个GHs蛋白定位于细胞外,3个定位在细胞质内,4个定位于线粒体上。【结论】葡萄霜霉菌在侵染寄主的过程中可能会分泌多种GHs酶类来破坏细胞壁的结构,以帮助其在寄主植物中成功定殖。
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