科研产出
环糊精水解酶cds1-3底物通道氨基酸的定点突变研究
《广西科学 》 2019
摘要：本研究对具有大分子水解能力的环糊精水解酶cds1-3的蛋白结构进行分析,选取底物通道相关氨基酸进行定点突变.通过比较突变酶和野生酶的功能差异,定位决定cds1-3特殊功能的氨基酸.采用sybyl 1.2进行蛋白质底物结合分析,选取和多聚体形成、底物结合以及底物通道相关的氨基酸Glu66、Pro48、Phe289为突变位点,反向PCR构建pSE380/E66G、pSE380/P48H、pSE380/F289A表达质粒并进行表达,获得酶活突变体并与原始酶进行底物特异性比较分析.其结果显示,突变酶E66G降解大分子底物木薯淀粉和支链淀粉的相对酶活力分别提高26.96%和23.15%,而对小分子底物普鲁兰糖的水解能力下降13.14%.因此,cds1-3是一个能水解大分子底物的特殊环糊精水解酶,氨基酸Glu66是cds1-3水解大分子支链淀粉的关键氨基酸之一.
关键词： 环糊精水解酶 同源建模 底物通道 定点突变 蛋白结构 氨基酸
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定点突变Ca~(2+)平衡位点对粘质沙雷氏菌脂肪的影响
《基因组学与应用生物学 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：为了研究粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)脂肪酶lip A中的Ca~(2+)对酶活力的影响,采用定点突变的方法对平衡Ca~(2+)的位点D388进行定点突变,对突变体进行诱导表达后,纯化目的蛋白并进行酶学性质分析。与野生酶相比,突变酶的最适温度由40℃降低到25℃,最适p H值由8.5降到8.0,T_(1/2)值比野生酶提高了2℃。由此可知,该Ca~(2+)对脂肪酶lip A酶学性质有着至关重要的作用。
关键词： 粘质沙雷氏菌 脂肪酶lipA Ca~(2+) 定点突变
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地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)外切葡聚糖酶CelB基因的发掘及功能鉴定
《生物技术通报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：从地衣芽孢杆菌的基因组数据中寻找与外切葡聚糖酶相似性高的DNA序列,发现在地衣芽孢杆菌基因组中CelB DNA片段具有很高的序列相似性。在大肠杆菌中对来自地衣芽孢杆菌的CelB基因DNA片段进行表达并纯化蛋白质。CelB蛋白质对纤维素底物具有活性。根据糖基水解酶家族48的保守活性位点设计突变策略对CelB进行突变,突变体丧失对底物的活性,说明它具有糖基水解酶家族48的外切葡聚糖酶的典型活性位点。
关键词： 外切葡聚糖酶 基因组信息学 地衣芽孢杆菌 蛋白质结构 定点突变
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谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶的定点突变及其酶学性质研究
《广西科学 》 2012
摘要：以已知晶体结构的Pseudomonas mesoacidophila MX-45菌株海藻酮糖合成酶(MutB)的晶体结构为模板,在SWISS-MODEL模建立谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶的立体结构,并对初始结构作能量优化,通过氨基酸序列比对,选择TreS-glu保守区内的氨基酸R245、D247、E289、F244和保守区外的氨基酸A288进行定点突变,并对突变酶F244C、F244L、F244W、F244Y、A288G、R245X、E289X、D247N、D247E进行纯化和酶学性质研究,比较突变子对酶活性和热稳定性的影响。结果表明,R245、E289突变为其它的19个氨基酸后酶活力全部丧失,D247E和D247N也丧失酶活,F244C、F244L、F244W、F244Y和A288G的比活力分别降低到TreS-glu的38%、24%、62%、64%和35%,A288突变成T288后没有酶活。与TreS-glu相比,F244C、F244W、A288G的Km值基本不变,F244L、F244Y对底物麦芽糖的亲和力降低,F244Y的最适反应温度和TreS-glu相同,均为27℃,而F244C、F244L、F244W和A288G的最适温度提高到32℃。与TreS-glu相比,突变酶的最适反应pH值均有所下降,其中F244C、F244Y和A288G的为7.5,比TreS-glu的8.0均下降了约0.5个单位,而F244L和F244W的为6.5,比TreS-glu的8.0均下降了近1.5个单位。与TreS-glu相比,突变酶的热稳定性均有不同程度提高,其中F244Y、F244W和A288G的Tm值比TreS-glu的提高约1℃,F244L提高约2℃,F244C提高了近4℃。
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