科研产出
花生NADH脱氢酶1亚基10B-like基因克隆表达分析及载体构建
《分子植物育种 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：NADH脱氢酶是线粒体氧化呼吸链上重要的复合物,对线粒体功能有至关重要的作用。本研究以花生品种"日花1号"为材料,利用RACE方法成功得到NADH脱氢酶1亚基10B-like基因(ND1-10B-like)的c DNA和DNA全长。基因开放阅读框为321 bp,编码106个氨基酸组成的肽链,预测的蛋白质分子量为12 570.29 Da,等电点为6.97。DNA序列包含一个内含子和两个外显子,共1 269 bp。检测了基因组织表达和胁迫表达情况,结果显示该基因在叶片中表达量最高,在青枯菌胁迫条件下0.5 h表达量即可升高到初始值的5.7倍,对生物胁迫反应非常迅速。并进一步构建了基因过表达载体p CAMBIA2300-OE-ND1和反义表达载体p CAMBIA2300-IN-ND1,并为进一步研究花生中该基因的功能及其在花生抗青枯病中的作用提供帮助。
关键词： 花生 日花1号 NADH脱氢酶1亚基10B-like 载体构建
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百合AGPase基因RNAi载体构建及遗传转化研究
《西南农业学报 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：【目的】AGPase基因可在百合鳞茎膨大发育过程中影响淀粉的合成代谢,从而调控鳞茎发育,构建干扰AGPase基因RNAi载体并遗传转化进行反向下调作用研究,可为该调控机制的研究提供更多信息。【方法】克隆300 bp的AGPase基因保守序列,利用Gateway技术通过BP反应将该序列插入入门载体p DONR221,进行LR反应将该序列正反向插入干扰载体p Jawohl8-RNAi中,经过酶切鉴定所构建RNAi载体的正确性;并通过农杆菌介导法转入百合组培苗中,PCR检测RNAi载体转化农杆菌,荧光定量PCR检测农杆菌转化植株的AGPase相对表达量变化。【结果】成功构建p DONR221-AGPase入门克隆与p Jawohl8-RNAi-AGPase表达载体,遗传转化百合愈伤诱导出AGPase表达量下调的转化植株。【结论】采用Gateway技术可方便构建RNAi表达载体,选择的AGPase保守序列能作为干扰片段对百合AGPase自身转录的mRNA进行下调。
关键词： 百合 AGPase基因 RNA干扰 载体构建 遗传转化
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红麻6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PDGH)基因克隆及RNAi载体构建
《南方农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆红麻不育系和保持系6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PDGH)基因,并构建其RNAi载体,为进一步研究其在红麻花药发育中的功能奠定基础。【方法】根据红麻花药转录组高通量测序数据结果和生物信息学方法获得6PDGH基因全长c DNA拼接序列,分别以红麻不育系(P3A)和保持系(P3B)的花药反转录c DNA及总DNA为模板克隆红麻6PGDH基因全长。依据RNAi载体设计原则,选取红麻6PGDH基因c DNA序列中段389 bp的特异片段做为RNA干扰片段,构建红麻6PGDH基因的RNAi载体。【结果】克隆获得的红麻不育系(P3A)和保持系(P3B)花药6PGDH基因全长均为1751 bp,均包含1458 bp的开放阅读框,编码485个氨基酸残基,无内含子;其碱基序列在不育系和保持系中仅存在两个碱基差异。该基因氨基酸序列(Gen Bank登录号KF964027)与拟南芥、玉米、大豆、苜蓿、三角叶杨、蓖麻的6PDGH同源性分别为75.07%、84.57%、86.50%、87.24%、91.19%和92.01%。成功构建了红麻6PGDH基因的RNAi载体,获得了干扰表达载体p ART27-p KANNIBAL-R1+2。【结论】成功克隆获得红麻6PGDH基因全长序列,构建的干扰表达载体可用于红麻6PGDH基因的功能研究。
关键词： 红麻花药 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 基因克隆 载体构建
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甘蔗DⅢ家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSDⅢ克隆及其hpRNA载体构建
《南方农业学报 》 2014 CSCD
摘要：【目的】克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建其hpRNA表达载体,为研究该基因生物学功能奠定基础。【方法】通过同源克隆获得甘蔗SofSPSDⅢ基因部分序列,利用RACE技术获得其全长cDNA。扩增SofSPSDⅢ目的基因约500 bp序列,利用中间载体pHANNIBAL构建该片段的hpRNA结构,然后用Not Ⅰ将整个hpRNA结构切下,克隆到双元植物表达载体pART27上,构建该基因的hpRNA表达载体。【结果】通过同源克隆和RACE技术获得SofSPSDⅢ基因全长cDNA序列,该基因全长3252 bp,5′端UTR长度59 bp,3′端UTR长度292 bp,开放阅读框(ORF)长度2895 bp,带有真核生物典型的poly(A)尾巴(GenBank登录号:HQ117935)。该基因编码蛋白含有964个氨基酸,理论分子量108.03kDa,等电点pI=6.66;SofSPSDⅢ与SoSPS2、SbSPS和TaSPS9的氨基酸序列同源性分别为99.0%、98.9%和90.0%。构建获得SofSPSDⅢ基因的hpRNA载体pART-DⅢ-Ri。【结论】成功克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建基hpRNA载体,可为下一步沉默该基因、进而解析该基因的生物学功能奠定基础。
关键词： 甘蔗 蔗糖磷酸合成酶 SofSPSDⅢ 克隆 发夹RNA 载体构建
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木薯AGPase基因的克隆与载体构建
《中国农学通报 》 2012 北大核心 CSCD
摘要：为了研究木薯淀粉合成酶关键基因AGPase在木薯淀粉合成中的作用,根据GenBank中其他物种AGPase小亚基基因序列,从高淀粉木薯‘辐选01’中克隆得到含3’末端的909bp的基因片段,回收克隆测序。结果显示,克隆获得片段与基因库中登录的蓖麻、毛果杨、甜橙、番薯、蜜柑、大豆同源性依次达到91%、91%、87%、86%、86%及85%。将阳性克隆与PBI121载体进行双酶切、连接,构建植物反义表达载体PBI121-AGPss,并将其导入农杆菌,得到农杆菌工程菌株。为进一步开展木薯淀粉合成相关的基因调控、转基因及基因功能研究奠定基础。
关键词： 木薯 PBI121-AGPss 基因克隆 载体构建
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