科研产出
酸碱滴定法优化香蕉磷脂酶A活性测定及炭疽病胁迫下其活性变化研究
《热带作物学报 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：植物磷脂酶A(phospholipase A,PLA)是细胞膜磷脂代谢中的关键酶，可以催化磷脂分子上多个功能基团发生裂解生成信号分子，参与调节植物生长发育以及环境和生物胁迫，具有重要研究价值。本研究主要考察底物浓度、反应温度、缓冲溶液pH、缓冲溶液体积、反应时间等多种因素对香蕉PLA催化卵磷脂水解活性的影响，从而优化磷脂酶A活性测定方法，进一步根据最佳测定条件研究炭疽病胁迫下香蕉PLA活性的变化趋势。结果表明，酸碱滴定法测定香蕉PLA活性的优化条件：反应体系pH 9，底物浓度为4 g/L，反应温度为55℃，底物为15 mL，酶粗提液为3 mL，提取缓冲液体积与果皮重量的比值（mL/g）为3，反应时间为7 h。在最优条件下对炭疽病胁迫下的香蕉果皮组织进行PLA活性测定，发现果皮的病害程度与PLA活力呈正相关，即随着病害程度加深，PLA活性增大，且远大于对照组。表明PLA活性大小可能与果实的抗性有关，随着果实病害程度加深，PLA活性增大，膜磷脂降解，细胞膜的完整性被破坏，从而导致果实腐烂。本研究明确了一种方便可行的香蕉PLA活性测定方法，为深入研究香蕉PLA的催化作用机制奠定基础。
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香蕉果实MaNPC1基因原核表达及多克隆抗体制备
《南方农业学报 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：【目的】对香蕉果实非特异性磷脂酶C基因（MaNPC1）开放阅读框（ORF）进行原核表达,并制备其多克隆抗体,为深入探究MaNPC1在香蕉果实抵御炭疽病中的作用机制提供理论依据。【方法】克隆MaNPC1基因ORF序列,对其进行生物信息学分析及抗原性预测,并通过双酶切法构建其原核表达载体,利用热激法转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞中进行诱导表达,重组蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫新西兰兔,以制备多克隆抗体。同时,运用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测香蕉果实贮藏过程中在炭疽病侵染胁迫下MaNPC1蛋白表达水平及MaNPC1基因相对表达量。【结果】重组质粒pGEX-6p-3-MaNPC1经双酶切后得到1650 bp的特异性条带,说明原核表达载体构建成功,将其转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞后成功表达。MaNPC1蛋白分子式为C2747 H4249 N769 O793 S10 ,分子量为61.06 k D,理论等电点（pI）为8.96;丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丝氨酸含量较高,分别占氨基酸总数的8.7%、8.2%、7.8%和7.7%;不稳定指数为47.14,表明其为不稳定蛋白;蛋白抗原区段丰富且亲水性氨基酸数目明显高于疏水性氨基酸,有利于后续抗体的制备。制备的多克隆抗体效价较高,为1∶2048000。Western blotting检测发现,香蕉果实贮藏过程中MaNPC1蛋白表达水平呈上升—下降—上升的变化趋势;炭疽病侵染组MaNPC1蛋白除贮藏15 d时的表达水平比对照组低外,其他贮藏时间均略高于对照组。实时荧光定量PCR检测结果表明,MaNPC1基因相对表达量在香蕉果实贮藏过程中呈逐渐上升趋势;贮藏315 d,炭疽病侵染组MaNPC1基因相对表达量均显著高于对照组（P<0.05）。【结论】炭疽病侵染能提高MaNPC1蛋白表达水平,故推测MaNPC1蛋白参与香蕉果实抵抗炭疽病侵染。
关键词： 香蕉 MaNPC1基因 原核表达 多克隆抗体 炭疽病 贮藏
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炭疽病胁迫下采后香蕉的膜脂代谢
《南方农业学报 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：【目的】从细胞膜降解角度研究芭蕉炭疽菌（Colletotrichum musae）采后侵染香蕉果实的机制,为进一步研究香蕉炭疽病及其防控措施提供理论依据。【方法】以桂蕉6号香蕉为试验材料,采用喷雾接种芭蕉炭疽菌侵染香蕉果实,以果实喷雾蒸馏水作对照,每3 d取样1次,通过测定采后贮藏过程中香蕉果实的病情指数、果实硬度及果皮电导率、细胞膜降解关键酶活性、细胞膜磷脂和脂肪酸组分与含量的变化规律,明确炭疽菌侵染对香蕉果皮膜脂代谢的影响。【结果】接种芭蕉炭疽菌可促进香蕉果实炭疽病的发生,病情指数随贮藏时间的延长而增加,同时果实硬度下降、果皮电导率升高,贮藏至第15 d,炭疽菌侵染组与对照组相比,果实的病情指数显著增加61.31%（P<0.05,下同）、果实硬度显著下降35.79%、果皮电导率显著升高27.94%。炭疽菌侵染促进香蕉果皮膜脂代谢相关酶[磷脂酶C（PLC）、磷脂酶D（PLD）和脂氧合酶（LOX）]活性增强,贮藏至第15 d,炭疽菌侵染组的果皮PLC、PLD和LOX活性较对照组分别显著提高31.21%、63.72%和26.24%;同时炭疽菌侵染加速果皮细胞膜磷脂[磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰乙醇胺（PE）]降解为磷脂酸（PA）、不饱和脂肪酸（油酸、亚油酸和亚麻酸等）氧化为饱和脂肪酸（棕榈酸和硬脂酸等）,贮藏至第15 d,与对照组相比,炭疽菌侵染组的果皮不饱和脂肪酸总量降低12.97%,饱和脂肪酸总量则提高17.77%。炭疽菌侵染促进香蕉果皮氧化,贮藏至第15 d,炭疽菌侵染组的丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）含量较对照组分别提高17.23%和13.58%。【结论】炭疽病菌侵染与贮藏期间香蕉果皮细胞膜脂代谢有关,炭疽菌侵染加剧细胞膜水解,导致细胞膜结构破坏和功能丧失,从而促使炭疽病发生。
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