科研产出
甘蔗HSP20基因克隆、原核表达及逆境胁迫响应
《植物生理学报 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：热激蛋白(HSP)以分子伴侣形式参与蛋白质组装、折叠、跨膜传导等生物过程,可以提高植物对多种逆境胁迫的耐受性。我们前期通过转录组测序技术(RNA-seq)研究发现甘蔗(Saccharum officinarum)HSP20基因在宿根矮化病菌(Leifsonia xyli subsp. xyli, Lxx)诱导下差异表达。为了探讨HSP20基因与甘蔗抗逆性的关系,本研究从甘蔗品种‘Badila’中克隆了HSP20基因,分析了甘蔗HSP20蛋白原核表达诱导条件以及HSP20基因在不同非生物胁迫[4°C (低温)、聚乙二醇(PEG;干旱)、NaCl (高盐)]及脱落酸(ABA)处理下的诱导表达情况。结果表明,甘蔗HSP20基因(GenBank登记号:MZ220548)全长735 bp,编码244个氨基酸,与高粱(Sorghum bicolor)亲缘关系最近;该基因编码蛋白分子质量为26.79 kDa,有较好的脂溶性,为不稳定亲水蛋白,且亚细胞定位预测HSP20蛋白位于叶绿体。HSP20蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)感受态Transetta (DE3)中诱导表达效果好于大肠杆菌感受态BL21 (DE3),使用0.05 mmol·L-1异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在28°C下诱导4 h,即可获得较好的诱导表达效果。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析表明,低温、干旱、高盐胁迫和脱落酸处理均能诱导甘蔗茎、叶中HSP20基因表达,茎、叶中HSP20基因通过不同表达模式响应这些非生物胁迫以及ABA处理,说明甘蔗HSP20基因在响应逆境胁迫中有重要作用。研究结果为甘蔗HSP20基因生物学功能研究以及甘蔗多重抗逆性研究提供参考。
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香蕉果实MaNPC1基因原核表达及多克隆抗体制备
《南方农业学报 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：【目的】对香蕉果实非特异性磷脂酶C基因（MaNPC1）开放阅读框（ORF）进行原核表达,并制备其多克隆抗体,为深入探究MaNPC1在香蕉果实抵御炭疽病中的作用机制提供理论依据。【方法】克隆MaNPC1基因ORF序列,对其进行生物信息学分析及抗原性预测,并通过双酶切法构建其原核表达载体,利用热激法转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞中进行诱导表达,重组蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫新西兰兔,以制备多克隆抗体。同时,运用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测香蕉果实贮藏过程中在炭疽病侵染胁迫下MaNPC1蛋白表达水平及MaNPC1基因相对表达量。【结果】重组质粒pGEX-6p-3-MaNPC1经双酶切后得到1650 bp的特异性条带,说明原核表达载体构建成功,将其转入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞后成功表达。MaNPC1蛋白分子式为C2747 H4249 N769 O793 S10 ,分子量为61.06 k D,理论等电点（pI）为8.96;丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和丝氨酸含量较高,分别占氨基酸总数的8.7%、8.2%、7.8%和7.7%;不稳定指数为47.14,表明其为不稳定蛋白;蛋白抗原区段丰富且亲水性氨基酸数目明显高于疏水性氨基酸,有利于后续抗体的制备。制备的多克隆抗体效价较高,为1∶2048000。Western blotting检测发现,香蕉果实贮藏过程中MaNPC1蛋白表达水平呈上升—下降—上升的变化趋势;炭疽病侵染组MaNPC1蛋白除贮藏15 d时的表达水平比对照组低外,其他贮藏时间均略高于对照组。实时荧光定量PCR检测结果表明,MaNPC1基因相对表达量在香蕉果实贮藏过程中呈逐渐上升趋势;贮藏315 d,炭疽病侵染组MaNPC1基因相对表达量均显著高于对照组（P<0.05）。【结论】炭疽病侵染能提高MaNPC1蛋白表达水平,故推测MaNPC1蛋白参与香蕉果实抵抗炭疽病侵染。
关键词： 香蕉 MaNPC1基因 原核表达 多克隆抗体 炭疽病 贮藏
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芒果MiRab11基因及突变体的原核表达分析
《热带作物学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：为研究芒果MiRab11蛋白的互作及其它生物学功能,本文在MiRab11基因序列基础上,采用重叠PCR定点突变技术,获得了2个结构域突变体Mi-Rab11CA和Mi-Rab11DN,将其构建原核表达载体,并成功转化大肠杆菌BL21。SDS-PAGE结果显示,在28℃条件下,用0.5 mmol/L IPTG诱导4 h,可获得大量可溶性蛋白的表达。将可溶性蛋白经Ni-NTA argrose层析柱纯化并western blot鉴定,该重组蛋白均可与抗His单克隆抗体发生特异性免疫反应。本研究为深入研究芒果pET-Rab11蛋白生理活性、特异性结合位点及功能调控打下良好基础。
关键词： 芒果 MiRab11 突变体蛋白 原核表达 纯化 鉴定
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烟曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析
《生物工程学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：探索获得优良的β-葡萄糖苷酶基因,对实现其工业化生产具有重要意义。烟曲霉Aspergillus fumigatus基因组中含有一个bgl基因(1 752 bp),编码的蛋白约65 kDa,推测为属于糖苷水解酶家族的β-葡萄糖苷酶。将bgl基因克隆并构建了重组表达载体pGEX-bgl,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导获得表达。重组蛋白经亲和层析纯化后,以七叶苷为底物进行了酶学分析,结果表明该酶的最适温度是45℃,最适pH在5.5~6.0之间,对七叶苷的Km值为17.7 mmol/L。该酶在pH 4~7范围内稳定;70℃保温2 h后仍能保持60%的活性。金属离子和化学试剂对酶活性有不同程度的影响,Ca2+对重组酶有轻微的激活作用,而SDS可强烈抑制其活性。由于其相对于真菌来源的其他葡萄糖苷酶稳定性较高,为进一步的研究与应用奠定了基础。
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甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSB的克隆及原核表达
《南方农业学报 》 2013 CSCD
摘要：【目的】克隆甘蔗B家族SofSPSB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue-2上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米(Zea mays)ZmSPS1和水稻(Oryza sativa)OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因(SofSPSB)2330bp序列。结合5'-RACE和3'-RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框(ORF);起始密码子(ATG)位于转录起始位点后56bp处,终止密码子(TGA)后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm-SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94.7%和81.3%,氨基酸序列同源性分别为96.0%和83.9%;其理论分子量Mw=118.96kDa,等电点pI=6.30。经原核表达后纯化获得带6×His标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sof-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SofSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。
关键词： 甘蔗 蔗糖磷酸合成酶 SofSPSB 克隆 原核表达
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龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因的克隆和表达分析
《中国农业科学 》 2012 北大核心
摘要：【目的】克隆龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因,分析其序列特征和在低温胁迫下不同组织中的表达情况并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从龙眼叶片中克隆DLCCoAOMT基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR研究DLCCoAOMT基因在不同组织中的表达。【结果】克隆得到DLCCoAOMT基因,GenBank登录号为JN093023。该cDNA全长993 bp,具有1个744 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸。序列分析表明,DLCCoAOMT编码的氨基酸序列与其它植物的CCoAOMT蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,龙眼DLCCoAOMT与桦木属的CCoAOMT蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量技术进行组织表达模式分析发现,DLCCoAOMT基因在根、茎、叶中均有表达。总体上表达量在根和茎中较多,叶中较少,随着低温胁迫时间延长,DLCCoAOMT基因在各组织的表达量也发生变化。原核表达结果表明,DLCCoAOMT基因在大肠杆菌中获得表达。【结论】从龙眼中克隆到咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因,该基因可能参与调控低温胁迫。
关键词： 龙眼 咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶 基因克隆 表达分析 原核表达
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龙眼成花逆转花芽α-tubulin基因的克隆与原核表达
《热带亚热带植物学报 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：运用蛋白质组学方法比较龙眼(Dimocarpus longanLour.)正常成花和成花逆转花芽的差异蛋白质组,并应用RACE方法克隆其中上调表达的α-微管蛋白基因α-tubulin,获得一段长度为1641 bp的cDNA,其中包括1个1350 bp的开放阅读框[GenBank登录号:FJ479617(GI:218202929)]。将α-tubulin全长cDNA在大肠杆菌中表达,获得1个约49.6 kD的外源蛋白,经Western blotting验证为α-微管蛋白。RT-PCR和Western blotting分别检测了α-tubulin在转录和翻译水平上的表达,结果表明,α-微管蛋白在成花逆转的龙眼花芽中上调表达,可能是逆转花芽形态差异表现的原因之一。
关键词： 龙眼 花芽 α-tubulin基因 克隆 原核表达
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干燥和复吸水条件下发菜过氧化物氧还蛋白差异表达与基因克隆
《应用与环境生物学报 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生固氮蓝藻,为探讨其耐旱的分子机理及对极端干旱环境的适应和保护机制,运用双向电泳技术(2-DE)、凝胶图像分析、MALDI-TOF-TOF/MS质谱鉴定和数据库检索,分析发菜过氧化物氧还蛋白(Peroxiredoxin)在持续干燥48 h和复吸水4 h后的差异表达水平,根据鉴定的过氧化物氧还蛋白已知氨基酸序列设计简并性引物克隆该基因,分析基因和氨基酸序列的同源性及对蛋白质二级结构进行预测,并研究其原核表达.结果表明,发菜过氧化物氧还蛋白在复吸水后的表达量明显高于干燥状态下的表达量。根据简并性引物克隆获得长度为639 bp的过氧化物氧还蛋白基因,GenBank登陆号为HM854286.序列比较分析显示该基因具有较高的保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋、β折叠和随机卷曲构成.将过氧化物氧还蛋白基因在大肠杆菌中表达,获得符合预期的外源重组蛋白(26.5×103),经Western blotting验证,该外源蛋白为过氧化物氧还蛋白.图10表1参25
关键词： 发菜 过氧化物氧还蛋白 双向电泳 差异表达 基因克隆 原核表达 耐旱
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人表皮生长因子(hEGF)基因的合成、鉴定及植物表达质粒的构建
《广西大学学报(自然科学版) 》 2002 CSCD
摘要：用 PCR方法合成了人表皮生长因子 ( h EGF)基因 ,构建了原核表达质粒 p2 0 T-h EGF,研究了原核表达的重组蛋白 h EGF的生物学活性 ,并构建了植物表达质粒 .研究表明 :无论是融合蛋白 GST-h EGF或纯化的h EGF蛋白 ,都有相当高的生物活性 ,h EGF蛋白对 Hela细胞的增殖有很好的促进作用 ,免疫小鼠亦能产生很高的免疫应答反应 .
关键词： 人表皮生长因子(hEGF) 基因克隆 原核表达
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