科研产出
一个外切菊粉酶基因的克隆表达及酶学性质
《生物加工过程 》 2013 CSCD
摘要：从马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)DSM 5418中克隆出外切菊粉酶(INU)的成熟肽编码区域,在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中实现了高效分泌表达,体积酶活力达到15.27 U/mL,进一步对重组酶进行了纯化与表征。经过(NH4)2SO4沉淀、透析和分子筛过滤后,得到了纯度大于95%的纯化重组酶,SDS-PAGE分析发现INU的表观相对分子质量为9.0×104,大于理论预测值6.0×104。纯化酶液的表征结果表明,INU的最适温度和最适pH分别为55℃和5.0,在此条件下INU对菊粉的Km值和比酶活分别为1.90 mmol/L和433.86 U/mg,对蔗糖的Km值和比酶活分别为27.81 mmol/L和1 249.49 U/mg,I/S值为0.34;HPLC分析表明,INU酶解菊粉的产物由果糖和葡萄糖组成;金属离子Mn2+、Fe3+、K+和Co2+对酶有促进作用,而Zn2+、Cu2+、Ni2+、SDS和EDTA对酶活力有不同程度的抑制作用。
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米根霉脂肪酶基因pro-ROL和m-ROL在毕赤酵母中的密码子优化、表达和酶学性质的比较分析(英文)
《生物工程学报 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：米根霉Rhizopus oryzae脂肪酶不仅在众多工业领域中具有良好的应用价值,其典型的分子内伴侣结构(Intramolecular chaperon)也是研究蛋白质翻译后加工和成熟的理想材料。以R.oryzae HU3005为材料,克隆了其脂肪酶前体基因(pro-ROL)和成熟脂肪酶基因(m-ROL),并实现了其在巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris GS115中的分泌表达。酶学性质比较分析表明:m-ROL对中等链长底物(C10和C12)具有更高的水解活性,而pro-ROL更倾向于短链底物(C4),且在pH 8.0时活性最高。再者,pro-ROL具有比m-ROL更好的温度稳定性。推测m-ROL和pro-ROL脂肪酶酶学性质的差异可能是由前序列对脂肪酶的折叠和修饰的影响而导致。为提高m-ROL的表达水平,采用重叠延伸PCR技术将基因中8个低频密码子替换为高频密码子。在摇瓶条件下,发酵72 h后,经密码子优化后的m-ROL酶活和蛋白质含量分别达到132.7 U/mL和50.4 U/mL,而初始m-ROL和pro-ROL酶活和蛋白质含量分别仅为28.7 U/mL和14.4 mg/L、29.6 U/mL和14.1 mg/L。
关键词： 米根霉脂肪酶 m-ROL pro-ROL 重叠延伸PCR 毕赤酵母
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酿酒酵母脂肪酶基因TGL3的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达
《生物技术 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：目的:克隆Saccharomy cescerevisiae脂肪酶基因,并实现其在Pichia pastoris中高效表达。方法:根据NCBIGenBank中已公布的Saccharomyces cerevisiae脂肪酶基因TGL3设计引物,以Saccharomyces cerevisiae总DNA为模板,PCR扩增目的片段,构建重组子pPIC9K-TGL3,转化到Pichia pastoris GS115。结果:扩增得到1929bp的基因片段,与GenBank中公布的序列氨基酸同源性达99.7%,编码的643个氨基酸中有脂肪酶的保守序列GXSXG,位于235～239位。重组子摇瓶发酵120h发酵液上清脂肪酶酶活达到60U/mL,酶学性质研究表明:该酶的最适作用温度为40℃,在25℃～40℃之间能保持60%以上酶活力。最适pH值为8.5,在pH6.5～9.0之间能保持50%以上的酶活力。除Al3+和Fe2+外,该酶不受Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ni+、Sr2+等多种金属离子的影响。结论:发酵液上清脂肪酶酶活达到60U/mL,是原菌株的10倍,成功实现了该基因的高效表达。
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