西番莲3种病毒多重RT-PCR检测方法的建立与应用

张莉娟; 吴凤; 黄婵婵; 谢晋; 李今朝; 单彬; 陆覃昱; 《农业研究与应用 》 2024

摘要：【目的】西番莲是一种具有很高经济价值的热带和亚热带水果，但无性繁殖方式导致病毒病成为西番莲产业发展的严重威胁。为了更好地监控田间西番莲病毒病的发生，特开展本研究，以期建立针对西番莲夜来香花叶病毒（telosma mosaic virus,TeMV）、东亚西番莲病毒（East Asian passiflora virus,EAPV）和黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus,CMV）的多重RT-PCR检测方法。【方法】根据已在GenBank上登记的3种病毒CP基因的保守序列，分别设计了针对TeMV、EAPV和CMV的3对特异性检测引物，通过试验确定了引物浓度、循环数、退火温度等条件，从而获得优化的多重RT-PCR反应体系，并验证了多重RTPCR的检测灵敏度，然后应用优化体系对广西田间采集的40个西番莲叶片样品进行3种病毒的检测。【结果】通过优化筛选，在20μL的PCR反应体系中实现了西番莲TeMV、EAPV、CMV 3种病毒的多重检测，最优反应条件是引物体积TeMV和EAPV各2μL、CMV3μL，循环数35次，退火温度54.9℃；验证结果表明，检测灵敏度最高可达104拷贝/μL。检测结果表明，3对特异性检测引物的扩增产物大小分别为496 bp、279 bp、157 bp。对西番莲叶片样品病毒进行检测的结果表明，TeMV、EAPV和CMV的检测结果分别是97.5%(39/40),95%(38/40)和2.5%(1/40)，而用单一RT-PCR的检测结果分别是100%(40/40), 95%(38/40)和2.5%(1/40)，多重RT-PCR检测结果和单一RT-PCR检测结果的符合度为99.16%(119/120)。同时，TeMV和EAPV倾向于复合侵染，其复合侵染率高达95%(38/40)。【结论】本研究建立了西番莲病毒多重RT-PCR检测的优化体系，能够同时快速、灵敏和可靠地检测TeMV、EAPV和CMV，为这3种西番莲病毒田间控制、检疫规划和诊断提供了基础。

关键词： 西番莲 TeMV EAPV CMV 多重RT-PCR