科研产出
中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其发酵条件优化
《食品与发酵工业 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：以枯草芽孢杆菌为表达系统,以中温α-淀粉酶为目标蛋白,研究了启动子和信号肽对外源蛋白表达分泌的影响。分别选取了4种启动子以及8种信号肽来进行筛选,结果表明,启动子PApr E的强度最高,信号肽SPnpr E的分泌效率最好。针对重组菌株1A751Q31进行系统的发酵优化,在72 h发酵液中α-淀粉酶酶活达到380U/m L。在7.5 L发酵罐中进行放大实验,发酵液中α-淀粉酶酶活最高达到853 U/m L。以上研究表明,α-淀粉酶适合在枯草芽孢杆菌中进行表达,同时表明枯草芽孢杆菌是良好的异源蛋白表达系统。
关键词： 枯草芽孢杆菌 α-淀粉酶 启动子 信号肽 发酵优化
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定量预测α-淀粉酶及其突变体的酶反应米氏常数(英文)
《广西科学 》 2014
摘要：【目的】α-淀粉酶是一种重要淀粉水解酶,而Km值是酶反应中重要的参数,尝试建立一种利用α-淀粉酶初级结构定量预测米氏常数Km值的有效模型。【方法】通过神经网络模型,利用535种氨基酸属性定量预测α-淀粉酶Amy7C及其52个突变体反应的Km值,其中33个酶用于模型训练,其余的用于模型验证。首先用双层的20-1前馈反向传播的神经网络进行预测,然后对多层神经网络模型进行筛选。【结果】535种氨基酸属性中有109种属性可以用模型预测,其中动态属性拟合结果较好,4个动态氨基酸属性中有3个属性可以用于模型预测,但拟合结果最好的氨基酸属性分别来自氨基酸理化性质和二级结构。对9种拟合和验证结果最好的氨基酸属性进行7种多层神经网络模型拟合,结果显示增加模型的复杂度并不能提高预测结果的精准度,表明较为简单的模型,如20-1或20-5-1是定量预测建模的首选。【结论】α-淀粉酶酶解反应的米氏常数Km,可以利用某些氨基酸属性通过神经网络模型进行定量预测。为今后利用酶的初级结构定量预测酶反应中各参数最适条件提供思路。
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α-淀粉酶Amy7C及其突变体最适pH值的定量预测
《广西科学 》 2014
摘要：【目的】pH值是影响酶催化效率的关键参数,通常需要通过实验方式才能确定生物酶的最适pH值,而该方式要消耗较多的人力、物力和时间。因此,有必要发展一种利用酶的简单结构信息即可预测其最适pH值的方法。【方法】以20-1前馈反向传播的神经网络为模型,完成535种氨基酸属性对α-淀粉酶pH值的拟合。同时,将α-淀粉酶Amy7C及其54个突变体的数据分为2组,用35个酶作为训练组进行拟合,20个酶作为验证组进行检验,并对不同层次及神经元个数的模型进行比较。【结果】109个氨基酸属性可实现20-1神经网络模型收敛,表明这些氨基酸属性可用于预测α-淀粉酶的最适pH值,但是不同氨基酸属性预测pH值的效果差别较大,只有部分指标预测pH值的效果较好。多模型的分析结果显示,不同模型对训练组R值的结果具有显著性差异,而对训练组P值、验证组R值和验证组P值结果无显著性差异。【结论】氨基酸分布概率等属性可用于预测α-淀粉酶的最适pH值。20-1神经网络模型是预测α-淀粉酶最适pH值相对理想的模型。
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地芽孢杆菌Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶的饱和突变及酶学性质研究
《生物技术通报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：采用半理性设计方法,在网站Geno3D上以PDB数据库中B.stearothermophilus麦芽糖淀粉酶(BSMA)的三维结构为模板,对AMY(α-淀粉酶)进行三维结构同源建模(二者氨基酸的同源性为33%)。比较同源建模预测的3D结构和模板BSMA的3D结构关键位点,在此基础上通过计算机辅助设计软件ProSa2003,根据能量变化确定了AMY三个饱和突变位点:D192、E221和D289。利用兼并引物对AMY的假定活性中心位点D192、E221和D289的氨基酸分别进行饱和突变,定点(饱和)突变库筛选得到4个有活力的突变子D192A、E221N、E221L和D289L,并对突变酶的酶学性质进行初步研究。
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富集宏基因组DNA中α淀粉酶全长基因的克隆及重组表达
《中国生物工程杂志 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：利用反向-巢式PCR(IN-PCR)从富集土壤宏基因组DNA中克隆到一种α-淀粉酶基因的全序列,其基因登录号为GU045523,测序分析显示与来自Bacillussp.KR-8104耐酸淀粉酶不完整基因同源性为99%。将获得的α-淀粉酶成熟肽基因与表达载体pSE380连接,导入Escherichia coliJM109中,IPTG诱导表达。粗酶液经Ni-NTA、SephacrylS-200纯化后测定酶学性质:重组酶GXAA的最适作用pH为7.0,最适作用温度为75℃,对可溶性淀粉的Km值为11.6g/L。构建突变子E27G、A450T、E27G-A450T,其酶学性质与原始酶没有显著差别。
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