科研产出
甘蔗DⅢ家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSDⅢ克隆及其hpRNA载体构建
《南方农业学报 》 2014 CSCD
摘要：【目的】克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建其hpRNA表达载体,为研究该基因生物学功能奠定基础。【方法】通过同源克隆获得甘蔗SofSPSDⅢ基因部分序列,利用RACE技术获得其全长cDNA。扩增SofSPSDⅢ目的基因约500 bp序列,利用中间载体pHANNIBAL构建该片段的hpRNA结构,然后用Not Ⅰ将整个hpRNA结构切下,克隆到双元植物表达载体pART27上,构建该基因的hpRNA表达载体。【结果】通过同源克隆和RACE技术获得SofSPSDⅢ基因全长cDNA序列,该基因全长3252 bp,5′端UTR长度59 bp,3′端UTR长度292 bp,开放阅读框(ORF)长度2895 bp,带有真核生物典型的poly(A)尾巴(GenBank登录号:HQ117935)。该基因编码蛋白含有964个氨基酸,理论分子量108.03kDa,等电点pI=6.66;SofSPSDⅢ与SoSPS2、SbSPS和TaSPS9的氨基酸序列同源性分别为99.0%、98.9%和90.0%。构建获得SofSPSDⅢ基因的hpRNA载体pART-DⅢ-Ri。【结论】成功克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建基hpRNA载体,可为下一步沉默该基因、进而解析该基因的生物学功能奠定基础。
关键词： 甘蔗 蔗糖磷酸合成酶 SofSPSDⅢ 克隆 发夹RNA 载体构建
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木薯可溶性淀粉合成酶基因SSII克隆及生物学分析
《北方园艺 》 2014 北大核心
摘要：以木薯品种SC124为试材,采用RT-PCR的方法,克隆了木薯可溶性淀粉合成酶基因SSII的全长,并对其进行生物学分析。结果表明:克隆的基因全长包含完整的开放阅读框2 256bp,编码751个氨基酸,通过核苷酸序列同源性分析,该cDNA与基因库中登录的木薯SSII(登录号为:EF667961.1)序列同源性达到99%,但与其它植物的同源性较低,为77%~84%。对木薯SSII多态性分析可知,在木薯基因组内存在等位基因及旁系同源基因。
关键词： 木薯 可溶性淀粉合成酶基因SSII 克隆 生物学分析
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花生栽野杂交后代抗病基因类似物的克隆与分析
《西北农林科技大学学报(自然科学版) 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：【目的】在花生野生种、栽培种及栽野杂交后代中,克隆抗病基因类似物(Resistance gene analog,RGA)相关基因片段,为抗病基因的进一步分离、鉴定及利用奠定基础。【方法】以14个花生栽野杂交种和2个抗病花生亲本为材料,应用PCR方法扩增来自基因组DNA的抗病基因类似物序列,并分析其同源性。【结果】扩增出15条来自基因组DNA的抗病基因类似物序列,序列长度在500bp左右,由此推导出的15条氨基酸序列含有典型的NBS保守区的N端糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点。15条花生RGA氨基酸序列间的同源性在73.2%~100.0%,与已发表的花生抗病基因类似物的相似性较高,达72.1%~100.0%;与已知的其他作物的抗病基因编码的氨基酸序列有34.1%~54.6%的同源性。【结论】分离到的15个花生抗病基因同源片段为抗病基因的部分序列。
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甘蔗乙烯受体Sc-ERS启动子的克隆与序列分析
《南方农业学报 》 2013 CSCD
摘要：【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Sc-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得Sc-ERS启动子序列1410bp,该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82%和80%。PlantCARE在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA-BOX和CAAT-BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测Sc-ERS基因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。
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产普鲁兰酶克雷伯氏菌的分离鉴定及酶学性质研究
《广西科学 》 2013
摘要：利用曲里苯蓝法从淀粉加工厂废水氧化池酸性污泥样品中筛选普鲁兰酶产生菌,对筛选到的GXAS-38菌株进行形态观察、生理生化特征分析、16SrDNA序列系统发育分析和普鲁兰酶酶学性质研究,并用PCR方法克隆GXAS-38菌株的普鲁兰酶基因。结果表明,GXAS-38菌株属于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae),其产普鲁兰酶的最适反应温度为60℃,在温度35～50℃时酶活较稳定;最适反应pH值5.5,在pH值5.0～7.5时酶活较稳定。Ca2+、Na+和Li+对GXAS-38菌株的普鲁兰酶活性有激活作用;Cu2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+和Ba2+对GXAS-38菌株的普鲁兰酶活性有抑制作用;螯合剂EDTA能够强烈地抑制GXAS-38菌株的普鲁兰酶活性,GXAS-38菌株的普鲁兰酶反应需要金属离子参与。GXAS-38菌株完整的普鲁兰酶编码基因全长3291bp,编码1096个氨基酸。
关键词： 普鲁兰酶 肺炎克雷伯氏菌 分离 鉴定 酶学性质 基因克隆
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割手密遗传作图最适分离群体的选择
《南方农业学报 》 2013 CSCD
摘要：【目的】筛选适合用于构建割手密遗传连锁图谱的分离群体,为后续的遗传连锁图谱构建和基因定位及遗传育种提供理论依据。【方法】基于"双假测交"理论,利用DNA水平上遗传差异较大且蔗糖分和分蘖率差异极显著的不同割手密无性系进行杂交获得3个不同杂交组合,对3个备选作图群体的分蘖率和蔗糖分进行变异、正态分布拟合分析及分子多态性分析。【结果】组合3(GXS85-12×GXS87-16)和组合13(云割①×田林)的分蘖率呈偏态分布,而组合5(GXS85-30×GXS87-16)的分蘖率呈近似正态分布;组合3和组合5的蔗糖分呈偏态分布,而组合13的蔗糖分呈近似正态分布。在分子多态性水平上,组合5亲本的遗传相似系数略高于组合3和组合13,而其后代平均遗传相似系数略低,但变幅较高。【结论】组合5(GXS85-30×GXS87-16,群体大小为245株)的分蘖率、蔗糖分遗传性相对稳定,群体来源比较广泛,分子多态性丰富,遗传多样性高,可作为分离群体用于构建遗传图谱。
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全雌系苦瓜ACC氧化酶基因cDNA克隆及序列分析
《生物技术通报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：为研究1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC氧化酶,ACO)基因在苦瓜性别分化中的作用,以全雌系苦瓜‘X-Hei-d-d’花蕾为试材,采用RT-PCR和RACE技术获得了ACC氧化酶基因(Mc-ACO1)的全长cDNA序列。该序列为1 137 bp(GenBank登录号:FJ459813),其完整开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量为37.30 kD,肽链N端缺失ACOs家族典型的1个保守区和2个保守二价铁离子/抗坏血酸依赖型双加氧酶氨基酸残基。序列分析表明,植物ACO基因的演化与其来源植物亲缘关系的一致性较高;与其他物种相比,苦瓜Mc-ACO1不同的氨基酸序列主要表现在肽链N端;苦瓜Mc-ACO1应属于黄瓜Cs-ACO2类成员,功能可能与性别分化相关。
关键词： 全雌系苦瓜 性别分化 ACC氧化酶 基因克隆 序列分析
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甘蔗苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的克隆和表达分析
《中国农业科学 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆甘蔗的苯丙氨酸解氨酶基因(PAL),分析其序列特征及其在不同组织和5种胁迫条件下的表达情况,为此基因在甘蔗抗逆育种中的应用提供理论支撑。【方法】利用串联飞行时间质谱仪对差异表达蛋白质进行质谱鉴定分析,通过RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号(ROC22)中克隆PAL,以生物信息学方法对其序列进行预测分析,利用real-time PCR分析PAL在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗PAL,命名为ScPAL,GenBank登录号为KC172559。该cDNA全长2 590 bp,含有1个2 115 bp的完整开放阅读框(ORF),编码704个氨基酸。序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIA),与其它植物的PAL蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScPAL与高粱的PAL蛋白亲缘关系较近。real-time PCR分析表明PAL为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的66倍。其在低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、NaCl和H2O2四种外源胁迫下均诱导表达,但表达模式不同。【结论】从甘蔗品种ROC22中克隆获得苯丙氨酸解氨酶基因(ScPAL),是典型的PAL家族成员,推测其参与了甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱和抗盐胁迫过程也起到某种作用。
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甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSB的克隆及原核表达
《南方农业学报 》 2013 CSCD
摘要：【目的】克隆甘蔗B家族SofSPSB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue-2上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米(Zea mays)ZmSPS1和水稻(Oryza sativa)OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因(SofSPSB)2330bp序列。结合5'-RACE和3'-RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框(ORF);起始密码子(ATG)位于转录起始位点后56bp处,终止密码子(TGA)后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm-SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94.7%和81.3%,氨基酸序列同源性分别为96.0%和83.9%;其理论分子量Mw=118.96kDa,等电点pI=6.30。经原核表达后纯化获得带6×His标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sof-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SofSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。
关键词： 甘蔗 蔗糖磷酸合成酶 SofSPSB 克隆 原核表达
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甘蔗脱落酸胁迫成熟诱导蛋白基因(SoASR)的克隆和表达分析
《生物技术通报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：采用同源克隆和RT-PCR技术克隆了甘蔗SoASR基因全长cDNA,GenBank登录号为JX470187,长度为753 bp,包括一个429 bp的开放阅读框,编码142个氨基酸的蛋白。同源性分析表明,甘蔗SoASR与大蕉、玉米和高粱聚为一小组,同源性分别为79%、93%和88%。将SoASR在大肠杆菌中表达,获得一个约32.0 kD的外源蛋白。实时荧光定量PCR分析结果表明,低温胁迫下该基因在抗寒性强的甘蔗品种桂糖28号(GT28)中表达量先升后降,在抗寒性弱的甘蔗品种园林6号(YL6)中则呈下降趋势;该基因的表达在两个甘蔗品种中均受ABA的诱导。这说明SoASR基因在甘蔗抗寒机制中发挥一定作用。
关键词： 甘蔗 脱落酸胁迫成熟诱导蛋白 克隆 表达
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