科研产出
干燥和复吸水条件下发菜过氧化物氧还蛋白差异表达与基因克隆
《应用与环境生物学报 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生固氮蓝藻,为探讨其耐旱的分子机理及对极端干旱环境的适应和保护机制,运用双向电泳技术(2-DE)、凝胶图像分析、MALDI-TOF-TOF/MS质谱鉴定和数据库检索,分析发菜过氧化物氧还蛋白(Peroxiredoxin)在持续干燥48 h和复吸水4 h后的差异表达水平,根据鉴定的过氧化物氧还蛋白已知氨基酸序列设计简并性引物克隆该基因,分析基因和氨基酸序列的同源性及对蛋白质二级结构进行预测,并研究其原核表达.结果表明,发菜过氧化物氧还蛋白在复吸水后的表达量明显高于干燥状态下的表达量。根据简并性引物克隆获得长度为639 bp的过氧化物氧还蛋白基因,GenBank登陆号为HM854286.序列比较分析显示该基因具有较高的保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋、β折叠和随机卷曲构成.将过氧化物氧还蛋白基因在大肠杆菌中表达,获得符合预期的外源重组蛋白(26.5×103),经Western blotting验证,该外源蛋白为过氧化物氧还蛋白.图10表1参25
关键词： 发菜 过氧化物氧还蛋白 双向电泳 差异表达 基因克隆 原核表达 耐旱
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宏基因组文库中的组成型启动子在大肠杆菌中的克隆
《基因组学与应用生物学 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：启动子是决定基因表达水平的重要因素之一。组成型表达启动子被认为是工业上表达重要蛋白质的理想启动子。本研究利用蔗糖为唯一碳源的基本培养基对榨糖废水浸润的土壤微生物宏基因组文库进行筛选,获得两个阳性克隆。对其中一个克隆的柯斯质粒进行亚克隆,利用在线启动子预测和序列比对工具对其中一个亚克隆子进行分析,获得一个启动子序列。然后,利用PCR方法将该启动子和地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因一起克隆到T载体上。结果表明该启动子在不加诱导剂的条件下能够在大肠杆菌中启动外源基因的高效表达。本研究结果为在生物领域中组成型启动子的应用研究提供了基础。
关键词： 启动子 组成型 宏基因组文库 克隆 α- 淀粉酶基因
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粘质沙雷氏菌脂肪酶基因的克隆表达和酶学性质的研究
《生物技术 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：目的:克隆粘质沙雷氏菌脂肪酶基因(lipA)使其在大肠杆菌BL21(DE3)中实现高效表达,并对重组酶进行酶学性质研究。方法:以产脂肪酶粘质沙雷氏菌总DNA为模板,PCR扩增脂肪酶基因lipA,构建重组表达载体pET-lipA,并将其导入大肠杆菌进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和酶学性质的测定。结果:经过优化培养条件,脂肪酶活力最高能达到104U/mL。重组脂肪酶的最适反应温度为40～45℃,最适pH为7.0～7.5,在50℃保温1h下仍能保持80%的酶活力,Ca2+、Sr2+、Mn2+和Mg2+对脂肪酶酶活有较强的激活作用,尤其是Ca2+使脂肪酶酶活提高了1倍多,而Ni2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+和Al3+对酶活具有较强的抑制作用,尤其是Zn2+和Al3+使酶活力几乎完全丧失。该酶对一些有机溶剂有较好的耐受性,与50%甲醇混合24h,仍能保持84%的酶活力。结论:该脂肪酶具有较好的热稳定性和甲醇耐受力,作为生产生物柴油的催化剂具有很大的应用价值,为基因工程酶法生产生物柴油打下良好的基础。
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短小芽孢杆菌HZbp脂肪酶基因的克隆表达
《工业微生物 》 2010 CSCD
摘要：以短小芽孢杆菌HZbp总DNA为模板以PCR的方式获得512 bp的脂肪酶基因,并在该基因的两端引入了EcoR1和Sal1的酶切位点,将该基因与大肠杆菌表达质粒pSE380连接,获得重组质粒pSE380-BPL。重组质粒转入大肠杆菌表达细胞株BL21,获得工程菌株BL21-BPL。序列分析显示所克隆的基因具有脂肪酶的保守G-X-S-X-G序列,SDS-PAGE电泳显示该脂脂肪酶的分子质量约为20 kDa。在LB培养基中,IPTG诱导浓度为1.0 mmol/L,33℃诱导培养10 h后,发酵液酶活达到8 U/mL。
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鼠李糖乳杆菌D-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
《生物技术通报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：利用PCR的方法从鼠李糖乳杆菌基因组DNA中扩增到D-(+)-乳酸脱氢酶基因(ldhD),并连接到载体pSE380上,构建表达质粒pSE-ldhD,将重组质粒pSE-ldhD转化大肠杆菌BL21(DE3),重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明ldhD在大肠杆菌中实现了表达,表达产物的分子量约为37kD。同时采用紫外分光光度法测定D-乳酸脱氢酶的酶活,测得重组菌株的D-乳酸脱氢酶活力为5.4U/mL,最适反应温度为35℃,最适pH为5.6。
关键词： D-(+)-乳酸脱氢酶 克隆 表达 鼠李糖乳杆菌
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丙酮丁醇梭菌ldhL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
《生物技术通报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：首次从丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)中克隆得到L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,ldhL)基因,并将其连接到pSE380表达载体上,得到重组质粒pSE380ldhL,将重组质粒转化到乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的Escherichia coli FMJl44大肠杆菌中进行表达。SDS-PAGE分析表达产物的分子量约为34kD,摇瓶发酵后用HPLC检测分析L-乳酸产量为2.4g/L,纯度达到99.9%,不需要再进行手性分离,为以后在工业上生物法生产高纯度的L-乳酸打下基础。
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酿酒酵母脂肪酶基因TGL3的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达
《生物技术 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：目的:克隆Saccharomy cescerevisiae脂肪酶基因,并实现其在Pichia pastoris中高效表达。方法:根据NCBIGenBank中已公布的Saccharomyces cerevisiae脂肪酶基因TGL3设计引物,以Saccharomyces cerevisiae总DNA为模板,PCR扩增目的片段,构建重组子pPIC9K-TGL3,转化到Pichia pastoris GS115。结果:扩增得到1929bp的基因片段,与GenBank中公布的序列氨基酸同源性达99.7%,编码的643个氨基酸中有脂肪酶的保守序列GXSXG,位于235～239位。重组子摇瓶发酵120h发酵液上清脂肪酶酶活达到60U/mL,酶学性质研究表明:该酶的最适作用温度为40℃,在25℃～40℃之间能保持60%以上酶活力。最适pH值为8.5,在pH6.5～9.0之间能保持50%以上的酶活力。除Al3+和Fe2+外,该酶不受Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ni+、Sr2+等多种金属离子的影响。结论:发酵液上清脂肪酶酶活达到60U/mL,是原菌株的10倍,成功实现了该基因的高效表达。
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甘蔗乙烯受体基因Sc-ERS的克隆与序列分析
《广西农业科学 》 2010
摘要：根据已知乙烯受体基因的序列信息,设计1对简并引物和1对特异引物,对甘蔗叶片基因组DNA进行PCR扩增,获得1个甘蔗乙烯受体基因(Sc-ERS)的片段,其大小为4310 bp,包含1个由5个外显子和4个内含子组成的4219 bp大小的完整编码区。Sc-ERS编码区与玉米乙烯受体ERS1基因(AY359578)、水稻乙烯受体ERS1基因(AY043031)编码区的同源性分别为91.4%、61.6%;推导Sc-ERS编码的蛋白包含636个氨基酸残基,与玉米、水稻乙烯受体基因所编码蛋白的氨基酸同源性分别为94.1%、89.4%。其推导蛋白结构分析结果显示,Sc-ERS编码的蛋白和玉米、水稻ERS1所编码的蛋白相同,在N段保守区含有3个跨膜结构,并由3个跨膜结构、GAF结构、HisKA和HATPase_c组成功能域。核苷酸序列分析和蛋白质结构分析结果表明,Sc-ERS基因属于ERS1基因。
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诸葛菜OvCYP86MF基因的克隆及其特性分析
《核农学报 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：为进一步阐明细胞色素P450基因CYP86MF在诸葛菜发育中的分子机理,本文根据已知同源基因保守序列设计特异引物,利用RT-PCR和RACE技术从诸葛菜中获得一个细胞色素P450基因(OvCYP86MF)全长cDNA序列,该序列全长为1876bp,含有1605bp的完整开放阅读框,可编码534个氨基酸,分子量和等电点分别为61.4kDa和6.90,具有细胞色素P450蛋白的典型特征,即保守结构域FNAGPRLCIG;原核表达显示该基因的融合蛋白在体外可以诱导表达;DANSTAR和Clustal W软件分析表明该基因的全长cDNA序列及其编码氨基酸序列与十字花科物种拟南芥相似性很高,达到80%以上,亲缘关系最近;与CYP86C亚家族成员在氨基酸水平上的相似性均高于50%,因此推断该基因属于CYP86C这个亚家族。Northern杂交分析表明该基因在花蕾中特异表达。
关键词： 诸葛菜 OvCYP86MF基因 克隆 表达
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甘蔗GA20氧化酶基因片段克隆及序列分析
《热带作物学报 》 2009 CSCD
摘要：以甘蔗茎尖为材料,根据其它植物的GA20氧化酶基因(GA20-oxidase)氨基酸保守区,设计一对简并引物。通过RT-PCR扩增得出1条约740bp大小的DNA片段,将其克隆至pMD18-T载体上,而后对重组克隆进行测序,结果表明所获得的甘蔗GA20氧化酶基因片段由740碱基组成,编码246个氨基酸。该基因片段具有其它植物GA20氧化酶基因中存在的保守区;同时,与多种单子叶植物的GA20氧化酶基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性在80%和75%以上。聚类分析显示,甘蔗和玉米最先聚类,推测在进化上具有较近的亲缘关系,其次与高粱、结缕草聚类,然后再与水稻聚类,其中进化关系最远的是簇毛麦和小麦。
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