科研产出
花生属人工异源多倍体进化早期基因表达变化的cDNA-SCoT分析
《作物学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：为了探索花生属异源多倍体进化理论和种间杂交过程所涉及的遗传机制,以四倍体栽培种花生与二倍体野生种A.doigoi及其种间杂种F1和早期多倍体世代(S0~S3)为材料,采用cDNA-SCoT技术研究花生属人工异源多倍体进化早期基因表达变化规律。12条SCoT引物共扩增出108个cDNA片段,获得差异片段80个,占扩增总条带数的74.07%,对其中的35个差异片段进行克隆测序,有26个和GenBank数据库中已录入的基因具有较高的相似性,包括能量与代谢相关基因(8个)、未知功能蛋白基因(3个)、抗逆性相关基因(4个)、信号传导相关基因(2个)和反转录转座子相关基因(9个)。这说明花生属种间杂交人工异源多倍化早期世代发生着快速、剧烈的基因表达变化;从中获得的一些差异基因片段可用于花生属异源多倍化的分子机制研究。
关键词： 花生 异源多倍化 cDNA-SCoT技术 基因表达
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烟曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析
《生物工程学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：探索获得优良的β-葡萄糖苷酶基因,对实现其工业化生产具有重要意义。烟曲霉Aspergillus fumigatus基因组中含有一个bgl基因(1 752 bp),编码的蛋白约65 kDa,推测为属于糖苷水解酶家族的β-葡萄糖苷酶。将bgl基因克隆并构建了重组表达载体pGEX-bgl,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导获得表达。重组蛋白经亲和层析纯化后,以七叶苷为底物进行了酶学分析,结果表明该酶的最适温度是45℃,最适pH在5.5~6.0之间,对七叶苷的Km值为17.7 mmol/L。该酶在pH 4~7范围内稳定;70℃保温2 h后仍能保持60%的活性。金属离子和化学试剂对酶活性有不同程度的影响,Ca2+对重组酶有轻微的激活作用,而SDS可强烈抑制其活性。由于其相对于真菌来源的其他葡萄糖苷酶稳定性较高,为进一步的研究与应用奠定了基础。
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宏基因组中不依赖辅酶B_(12)甘油脱水酶基因的筛选和表达
《基因组学与应用生物学 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：通过特定的引物,以土壤宏基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得3.3 kb的DNA片段,该片段连接于pSE380载体构建重组质粒pSE380-dhaB12用于测序和表达。序列分析表明,该DNA片段编码的氨基酸序列与已报导的丁酸梭菌不依赖辅酶B12甘油脱水酶的相似性达99%。通过IPTG诱导,dhaB12基因在大肠杆菌中表达成功,SDS-PAGE分析表明有88 kD和34 kD两条蛋白质条带,在没有辅酶B12存在的情况下,所表达的酶具有明显的甘油脱水酶活性。
关键词： 宏基因组 不依赖辅酶B12 甘油脱水酶 筛选 表达
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厌氧梭菌表达载体在大肠杆菌中的直接表达及活性筛选
《应用与环境生物学报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：厌氧微生物的代谢途径改造、重组基因表达等分子生物学操作步骤多,易造成氧气接触,从而导致厌氧微生物死亡.针对厌氧梭菌-大肠杆菌穿梭载体的构建和筛选问题,利用纤维素内切酶基因Cphy3367作为报告基因,分析穿梭载体的硫解酶启动子在大肠杆菌中启动基因转录表达的可能性.含有重组质粒pSOS95-Cphy3367的大肠杆菌菌株相对于对照菌株生长迟缓,生物量降低.实时定量PCR检测及重组蛋白酶活检测结果中,发现硫解酶启动子在大肠杆菌中能启动基因转录表达,在37℃温度下48 h后达到高峰.表明硫解酶启动子在大肠杆菌中可以被宿主识别和启动基因表达,基因可以翻译成为蛋白质.在厌氧梭菌的穿梭载体构建中,含有硫解酶启动子的载体可以在大肠杆菌中进行重组载体的活性筛选这个步骤,从而降低梭菌厌氧操作的复杂度和难度.
关键词： 厌氧梭菌 硫解酶启动子 大肠杆菌 重组表达 纤维素酶 菌株筛选
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一个外切菊粉酶基因的克隆表达及酶学性质
《生物加工过程 》 2013 CSCD
摘要：从马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)DSM 5418中克隆出外切菊粉酶(INU)的成熟肽编码区域,在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中实现了高效分泌表达,体积酶活力达到15.27 U/mL,进一步对重组酶进行了纯化与表征。经过(NH4)2SO4沉淀、透析和分子筛过滤后,得到了纯度大于95%的纯化重组酶,SDS-PAGE分析发现INU的表观相对分子质量为9.0×104,大于理论预测值6.0×104。纯化酶液的表征结果表明,INU的最适温度和最适pH分别为55℃和5.0,在此条件下INU对菊粉的Km值和比酶活分别为1.90 mmol/L和433.86 U/mg,对蔗糖的Km值和比酶活分别为27.81 mmol/L和1 249.49 U/mg,I/S值为0.34;HPLC分析表明,INU酶解菊粉的产物由果糖和葡萄糖组成;金属离子Mn2+、Fe3+、K+和Co2+对酶有促进作用,而Zn2+、Cu2+、Ni2+、SDS和EDTA对酶活力有不同程度的抑制作用。
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甘蔗Cu/Zn-SOD的克隆和表达分析
《中国农业科学 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆甘蔗铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因,并分析其序列特征、组织特异性表达及在不同逆境胁迫下的表达模式。【方法】以甘蔗桂糖28号为材料,利用RT-PCR技术克隆获得Cu/Zn-SOD,采用生物信息学方法分析所推测的氨基酸序列,通过实时荧光定量PCR研究Cu/Zn-SOD在不同组织及逆境条件下的表达情况。【结果】克隆获得甘蔗Cu/Zn-SOD,NCBI登录号为JQ958328,其开放阅读框为456 bp,编码151个氨基酸,与禾本科植物聚于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明Cu/Zn-SOD在根、茎、叶中均有表达,为组成型表达,在叶中表达量最高;Cu/Zn-SOD在聚乙二醇(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H2O2四种非生物胁迫下均诱导表达,表达模式因调控机制的不同而异。【结论】克隆获得Cu/Zn-SOD,其主要在甘蔗绿色组织中表达,其在铜/锌SOD超氧化物歧化酶的功能区域保守型很高,可能与甘蔗抵御渗透胁迫相关。
关键词： 甘蔗 铜/锌超氧化物歧化酶 逆境 表达分析 实时荧光定量PCR
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甘蔗苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的克隆和表达分析
《中国农业科学 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆甘蔗的苯丙氨酸解氨酶基因(PAL),分析其序列特征及其在不同组织和5种胁迫条件下的表达情况,为此基因在甘蔗抗逆育种中的应用提供理论支撑。【方法】利用串联飞行时间质谱仪对差异表达蛋白质进行质谱鉴定分析,通过RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号(ROC22)中克隆PAL,以生物信息学方法对其序列进行预测分析,利用real-time PCR分析PAL在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗PAL,命名为ScPAL,GenBank登录号为KC172559。该cDNA全长2 590 bp,含有1个2 115 bp的完整开放阅读框(ORF),编码704个氨基酸。序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIA),与其它植物的PAL蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScPAL与高粱的PAL蛋白亲缘关系较近。real-time PCR分析表明PAL为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的66倍。其在低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、NaCl和H2O2四种外源胁迫下均诱导表达,但表达模式不同。【结论】从甘蔗品种ROC22中克隆获得苯丙氨酸解氨酶基因(ScPAL),是典型的PAL家族成员,推测其参与了甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱和抗盐胁迫过程也起到某种作用。
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可溶性酸性转化酶SAI基因在不同甘蔗基因型中表达分析
《中国糖料 》 2013
摘要：探讨与蔗糖代谢相关的甘蔗可溶性酸性转化酶(soluble acid invertase,SAI)基因时空表达,比较了桂糖28号(GT28)、拔地拉、新台糖20号(ROC20)、新台糖22号(ROC22)四个甘蔗基因型的+1、0叶、幼嫩叶鞘和幼茎4个部位在工艺成熟期中甘蔗SAI基因的表达水平。结果表明,在工艺成熟期甘蔗SAI在4个甘蔗基因型中4个部位均检测到其有表达,但甘蔗SAI表达水平在不同甘蔗基因型与组织部位因在不同工艺成熟阶段而有所差异。其中,SAI基因在工艺成熟前期有较高表达,而后逐渐下低,但在不同基因型的不同部位中表达规律性不是很明显,这可能与所用的甘蔗材料遗传背景等有关。
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甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSB的克隆及原核表达
《南方农业学报 》 2013 CSCD
摘要：【目的】克隆甘蔗B家族SofSPSB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue-2上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米(Zea mays)ZmSPS1和水稻(Oryza sativa)OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因(SofSPSB)2330bp序列。结合5'-RACE和3'-RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框(ORF);起始密码子(ATG)位于转录起始位点后56bp处,终止密码子(TGA)后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm-SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94.7%和81.3%,氨基酸序列同源性分别为96.0%和83.9%;其理论分子量Mw=118.96kDa,等电点pI=6.30。经原核表达后纯化获得带6×His标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sof-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SofSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。
关键词： 甘蔗 蔗糖磷酸合成酶 SofSPSB 克隆 原核表达
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甘蔗脱落酸胁迫成熟诱导蛋白基因(SoASR)的克隆和表达分析
《生物技术通报 》 2013 北大核心 CSCD
摘要：采用同源克隆和RT-PCR技术克隆了甘蔗SoASR基因全长cDNA,GenBank登录号为JX470187,长度为753 bp,包括一个429 bp的开放阅读框,编码142个氨基酸的蛋白。同源性分析表明,甘蔗SoASR与大蕉、玉米和高粱聚为一小组,同源性分别为79%、93%和88%。将SoASR在大肠杆菌中表达,获得一个约32.0 kD的外源蛋白。实时荧光定量PCR分析结果表明,低温胁迫下该基因在抗寒性强的甘蔗品种桂糖28号(GT28)中表达量先升后降,在抗寒性弱的甘蔗品种园林6号(YL6)中则呈下降趋势;该基因的表达在两个甘蔗品种中均受ABA的诱导。这说明SoASR基因在甘蔗抗寒机制中发挥一定作用。
关键词： 甘蔗 脱落酸胁迫成熟诱导蛋白 克隆 表达
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