科研产出
柠檬F-box基因的克隆及表达分析
《分子植物育种 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：本研究以香水柠檬幼嫩叶片为材料,在前期通过De Novo技术获得的F-box基因片段基础上设计引物,利用RT-PCR技术成功克隆出长度为585 bp的F-box基因,命名为LFB1,该基因编码194个氨基酸,该氨基酸序列在N端具有F-box结构域,生物信息学分析表明:该蛋白分子量为48.94 k D,等电点:5.2。进化分析发现其与克里曼丁桔(Citrus clementina)聚在一起。q RT-PCR分析表明:该基因在植株的根、茎、嫩叶、老叶、花蕾、花苞、幼果、成熟果中均有表达,LFB1基因在组织中的表达量是:茎>老叶>根>花蕾>成熟果>嫩叶>幼果;在花的不同器官的表达分析,发现该基因在雄蕊中的表达量最高,其它组织则相对较低,在雄蕊中基因的表达量是其它组织的10倍左右;在逆境胁迫下,该基因的表达量发生明显变化,表明该基因与植株的生长发育、花粉的发育以及环境胁迫可能有着一定的关系。
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甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶基因(SoNADP-IDH)的克隆与表达分析
《中国农业科学 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】甘蔗是C4作物,是中国最重要的糖料作物和最有希望的能源作物。克隆甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶(So NADP-IDH)基因,为甘蔗的抗病乃至抗逆育种提供候选基因。【方法】采用双向电泳技术找到差异蛋白点,用质谱技术对相应蛋白点进行鉴定,用RT-PCR技术从甘蔗中克隆So NADP-IDH,用在线软件对获得的氨基酸序列进行分析,并用q RT-PCR技术研究So NADP-IDH在不同组织和不同逆境胁迫条件下的表达特性。【结果】质谱成功鉴定出差异蛋白点并克隆获得该基因,命名为So NADP-IDH,Gen Bank登录号为KF808326。该c DNA全长1 497 bp,含有1个1 239 bp的完整开放阅读框(ORF),编码412个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白为亲水蛋白,不含信号肽,为稳定蛋白,有跨膜区域,为可溶性蛋白,二级结构分析显示,含有α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲,并且α-螺旋和无规则卷曲占据了该蛋白质二级结构的大部分构成。在线软件分析表明该基因含有19个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个N-肉豆蔻酰化作用位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点。多重序列和系统进化树分析表明,So NADP-IDH所编码的氨基酸序列与其他植物的异柠檬酸脱氢酶(IDH)蛋白有很高的同源性,与玉米的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明,So NADP-IDH在甘蔗的根、茎、叶中均有表达,在甘蔗体内为组成型表达,在生物胁迫(RSD病菌)和4种非生物胁迫下低温(4℃)、干旱(PEG)、高盐(Na Cl)和激素(ABA)均可影响So NADP-IDH在甘蔗体内的表达,且表达模式不同。在PEG模拟的干旱胁迫下,So NADP-IDH的表达表现出先上调后下调的表达模式,6 h表达量升到最高,之后又开始持续下降,在处理48 h时表达量降到最低;在4℃处理的低温胁迫下,3 h时,So NADP-IDH的表达量降到最低,之后随着处理时间的延长,So NADP-IDH的表达量增加,24 h升到最高点,48 h时,又有稍微下降;在ABA作用下,So NADP-IDH表现出"抑-扬-抑-扬"的表达模式,在处理3 h时So NADP-IDH表达量有所降低,6 h时升到最高,在处理24 h时降到最低,48 h又有所上升;在Na Cl模拟的高盐胁迫下,So NADP-IDH表现出"扬-抑-扬"的表达模式,So NADP-IDH的表达量在处理6 h时升到最高,之后开始急剧下降,24 h时降到最低,之后开始有所上升,48 h时基本与对照持平。【结论】从甘蔗中获得了NADP异柠檬酸脱氢酶(So NADP-IDH)基因,RSD病菌的侵染及上述4种非生物逆境胁迫均影响到So NADP-IDH在甘蔗体内的表达水平,该基因可能参与了甘蔗抵抗氧化胁迫的过程。
关键词： 甘蔗 NADP异柠檬酸脱氢酶 基因克隆 表达分析
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甘蔗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因Sc-SAMDC3的克隆和表达分析
《南方农业学报 》 2015 北大核心 CSCD
摘要：【目的】同源克隆干旱胁迫诱导下甘蔗(Saccharum officinarum)S-腺苷蛋氨酸脱羧酶3(S-adenosylmethionine Decarboxylase 3,SAMDC3)基因主编码区(mORF),并进行生物学信息及其表达特性分析为该基因遗传转化研究奠定基础。【方法】以甘蔗Sc-SAMDC3基因序列为模板设计引物,克隆Sc-SAMDC3基因mORF并使用相关软件进行序列分析。采用实时荧光定量PCR分析Sc-SAMDC3基因在PEG-6000胁迫下的表达特性。【结果】Sc-SAMDC3基因主编码区长度为1188 bp编码395个氨基酸。氨基酸序列分析结果显示,甘蔗SAMDC3有β折叠16个、α螺旋6个、卷曲3个,盘曲或折叠形成三级结构,酶活性中心残基位点分别位于第77、92、243、256位氨基酸残基,标志片段的酶原加工位点和PEST结构域与高粱、玉米高度保守。在25%PEG-6000胁迫2-24 h期间,Sc-SAMDC3基因的表达随胁迫诱导时间的延长而呈上调表达;至24 h时,其表达量为对照的8.26倍。【结论】克隆获得的Sc-SAMDC3基因表达受PEG-6000胁迫强烈诱导,可能参与甘蔗对干旱逆境胁迫响应的代谢调控。
关键词： 甘蔗 S-腺苷蛋氨酸脱羧酶 Sc-SAMDC3 克隆 PEG胁迫
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杧果Rab蛋白基因MiRab11的克隆及表达分析
《园艺学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：根据前期对杧果(Mangifera indica L.)胁迫差异分析中获得的Rab11片段,采用RT-PCR结合RACE技术,从‘四季杧’混合组织材料(叶、茎、花和果实)中克隆了一个Rab11完整编码区序列,命名为MiRab11。其cDNA全长902 bp,包含完整开放阅读框657 bp,编码218个氨基酸。同源性分析表明MiRab11与葡萄和柑橘的同源性最高(相似度均为97%)。实时荧光定量检测结果表明:MiRab11在杧果叶、茎、花和果实中均有表达,在嫩茎和花后70 d的成熟果实中的表达较高;在果实形成及发育初期表达量略有下调,但在果实成熟过程中表达量明显上调;逆境胁迫(低温、盐、干旱)处理可引起在叶或茎中上调表达;不同信号物质(脱落酸、水杨酸、双氧水)刺激均可引起叶中的表达上调。结果表明,MiRab11可能在杧果果实成熟和胁迫反应中发挥重要作用。
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红麻6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PDGH)基因克隆及RNAi载体构建
《南方农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆红麻不育系和保持系6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PDGH)基因,并构建其RNAi载体,为进一步研究其在红麻花药发育中的功能奠定基础。【方法】根据红麻花药转录组高通量测序数据结果和生物信息学方法获得6PDGH基因全长c DNA拼接序列,分别以红麻不育系(P3A)和保持系(P3B)的花药反转录c DNA及总DNA为模板克隆红麻6PGDH基因全长。依据RNAi载体设计原则,选取红麻6PGDH基因c DNA序列中段389 bp的特异片段做为RNA干扰片段,构建红麻6PGDH基因的RNAi载体。【结果】克隆获得的红麻不育系(P3A)和保持系(P3B)花药6PGDH基因全长均为1751 bp,均包含1458 bp的开放阅读框,编码485个氨基酸残基,无内含子;其碱基序列在不育系和保持系中仅存在两个碱基差异。该基因氨基酸序列(Gen Bank登录号KF964027)与拟南芥、玉米、大豆、苜蓿、三角叶杨、蓖麻的6PDGH同源性分别为75.07%、84.57%、86.50%、87.24%、91.19%和92.01%。成功构建了红麻6PGDH基因的RNAi载体,获得了干扰表达载体p ART27-p KANNIBAL-R1+2。【结论】成功克隆获得红麻6PGDH基因全长序列,构建的干扰表达载体可用于红麻6PGDH基因的功能研究。
关键词： 红麻花药 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 基因克隆 载体构建
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利用改良RACE方法克隆木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的研究
《中国农学通报 》 2014 CSCD
摘要：首次从木薯中分离克隆出AGPase小亚基的基因5’端cDNA序列,最终为进一步成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的cDNA全长序列提供依据。本研究以木薯作为试验材料,设计锚定引物,并根据木薯AGPase小亚基基因已知序列设计PCR特异引物,利用逆转录引物AUP1反转录总RNA,然后分离纯化反转录产物,通过对三大酶促反应(逆转录反应,TdT加尾,巢式及降落PCR技术)的具体改良,并将其与传统方法进行比较。利用改良后方法,首次成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因5’端cDNA序列。同时,本研究通过对RACE技术的改良与传统方法相比,在操作上更加简单、快速;在序列获得上更加高效;在试验成本上更加低廉。本研究可以高效且快速的成功获得木薯淀粉关键酶AGPase小亚基基因5’端序列,具有一定的实用性及简便性。
关键词： 木薯 AGPase小亚基基因 克隆 5’端 改良RACE方法
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木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因全长克隆
《南方农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：【目的】克隆木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)小亚基基因cDNA全长序列,为木薯高淀粉品种的分子育种提供依据。【方法】根据木薯AGPase小亚基基因已知片段设计特异性引物,以木薯根、茎、叶为材料,利用PCR及RACE克隆木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列。运用生物信息学方法对其核苷酸序列和推导氨基酸的理化性质、蛋白质三级结构进行系统分析。【结果】克隆获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基cDNA全长1566bp,其中包括1566bp的完整ORF,编码一个含521个氨基酸的多肽。其理论蛋白质分子量57.01kDa,等电点6.1,呈酸性。多重序列比较分析结果显示,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基核苷酸序列与蓖麻、麻风树和杨树相应序列的相似性分别为87%、87%和86%。结合系统进化树分析结果推测,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基在不同物种及进化过程中具有高度的保守性。蛋白三级结构分析结果表明,木薯AGPase小亚基蛋白具有15个α-螺旋、24个β-折叠和多个转角。【结论】木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列与蓖麻、麻风树和杨树等具有较高的同源性。
关键词： 木薯 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase) 基因克隆 序列分析 基因全长
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杧果低分子量热激蛋白基因MiHSP17.6的克隆及表达分析
《园艺学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：采用RT-PCR与RACE相结合的方法获得了杧果低分子量热激蛋白基因的c DNA全长序列,命名为Mi HSP17.6,Gen Bank登录号为KJ459857。序列分析显示,该基因序列全长为680 bp,其中开放阅读框为462 bp,编码154个氨基酸,5′非编码区和3′非编码区长度分别为80 bp和135 bp。杧果Mi HSP17.6与其他物种的低分子量热激蛋白同源性介于74%~82%。实时荧光定量分析表明,Mi HSP17.6在‘四季杧’不同组织器官中均表达,在果实发育的中期表达水平持续上升。高温(44℃)、低温(4℃)、盐(Na Cl)、聚乙二醇(PEG)、脱落酸(ABA)、双氧水(H2O2)和水杨酸(SA)处理均诱导该基因表达,因此推测Mi HSP17.6的功能可能与杧果果实发育和抵御逆境胁迫相关。
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甘蔗类异黄酮还原酶(IRL)基因的克隆与表达分析
《生物技术通报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：采用RT-PCR技术从甘蔗中克隆So IRL基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR技术研究So IRL基因在甘蔗不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。结果表明,克隆获得甘蔗So IRL,Gen Bank登录号为KF808324。该c DNA全长1 169 bp,含有1个927 bp的完整开放阅读框(ORF),编码309个氨基酸。系统进化树分析显示,甘蔗So IRL与玉米的IRL蛋白亲缘关系较近。q RT-PCR分析表明So IRL在甘蔗根、茎、叶中均有表达;在RSD病菌及低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、Na Cl和脱落酸(ABA)4种非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同。说明该基因可能参与甘蔗应答RSD过程,并可能在非生物胁迫中也发挥了作用。
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甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nifH基因的克隆与序列分析(英文)
《南方农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：【目的】了解甘蔗内生固氮菌变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)DX120E nif H基因的生物信息学,为揭示甘蔗内生固氮菌DX120E的固氮分子机理提供理论依据。【方法】根据NCBI上其他固氮菌株的nif H序列设计引物,对内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E菌进行PCR扩增;运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测。【结果】甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nif H基因的ORF为882bp,Gen Bank登录号为KF732646.1,与Klebsiella pneumoniae 342、Klebsiella variicola At-22等6种固氮菌的nif H基因氨基酸序列同源性高达95.0%~99.0%。DX120E nif H蛋白与Klebsiella pneumoniae 342的亲缘关系最近,与非克雷伯氏菌固氮菌的亲缘关系较远。生物信息学分析显示,菌株DX120E的nif H基因编码293个氨基酸,起特别重要的氨基酸残基非常保守。该基因在N端有11个氨基酸残基即酪氨酸—甘氨酸—赖氨酸—甘氨酸—甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—赖氨酸—丝氨酸—苏氨酸—苏氨酸,其属于典型结合ATP的基序结构。nif H蛋白分子量为32.07k D,p I为4.92,为酸性蛋白;其具有2个ASN糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,6个CK2磷酸化位点,6个PKC磷酸化位点。疏水性预测显示该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽。【结论】变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)DX120E nif H基因的推导氨基酸序列与克雷伯氏菌固氮菌属具有较高的同源性,该基因在甘蔗生物固氮过程中可能起重要作用。
关键词： 甘蔗 内生固氮菌 变栖克雷伯氏菌 nif H基因 克隆
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